Berdaq nomidagi qoraqalpoq davlat universiteti biologiya fakulteti umumiy biologiya va fiziologiya kafedrasi
II BOB. Rekombinant DNK olish va genlarni klonlash
Download 0.77 Mb.
|
| II BOB. Rekombinant DNK olish va genlarni klonlash
2.1 O’simliklar irsiyatini genetik injeneriya bilan o’zgartirish O'simliklar genetikasi o'rganishdir genlar, genetik o'zgarishva irsiyat xususan o'simliklar. Odatda bu maydon deb hisoblanadi biologiya va botanika, lekin boshqalar bilan tez-tez kesishadi hayot fanlari va o'rganish bilan chambarchas bog'liq axborot tizimlari. O'simliklar genetikasi ko'p jihatdan hayvonlarning genetikasiga o'xshash, ammo bir nechta asosiy yo'nalishlarda farq qiladi. Genetika kashfiyotchisi bo'lgan Gregor Mendel,19-asr oxiri olim va Avgustin friar. Mendel "xususiyat merosxo'rlik" ni o'rgangan, bu xususiyatlarni ota-onadan avlodga etkazishdagi naqshlar. U organizmlar (eng mashhur no'xat o'simliklari) xususiyatlarni diskret "meros birliklari" orqali meros qilib olishini kuzatgan. Hozirgi kunda ham qo'llanilgan ushbu atama a deb ataladigan narsaning biroz noaniq ta'rifidir gen. Mendelning o'simliklar bilan ishlashining ko'p qismi hanuzgacha zamonaviy o'simliklar genetikasi uchun asos bo'lib xizmat qiladi. O'simliklar, ma'lum bo'lgan barcha organizmlar singari, o'z xususiyatlarini etkazish uchun DNKdan foydalanadilar. Hayvonlarning genetikasi ko'pincha ota-ona va nasl-nasabga qaratilgan, ammo bu o'simliklar genetikasida ba'zan qiyin bo'lishi mumkin, chunki o'simliklar, aksariyat hayvonlardan farqli o'laroq, o'z-o'zini serhosil. Spetsifikatsiya o'ziga xos genetik qobiliyat tufayli ko'plab o'simliklarda osonroq bo'lishi mumkin, masalan yaxshi moslangan poliploidiya. O'simliklar noyobdir, chunki ular energiyani zich uglevodlarni ishlab chiqarish imkoniyatiga ega fotosintez, foydalanish orqali erishiladigan jarayon xloroplastlar. Xloroplastlar, xuddi yuzaki o'xshash mitoxondriya, o'zlarining DNKlariga ega. Shunday qilib, xloroplastlar genlar va genetik xilma-xillik uchun qo'shimcha suv omborini va hayvonlarda mavjud bo'lmagan genetik murakkablikning qo'shimcha qatlamini ta'minlaydi. O'simliklar genetikasini o'rganish katta iqtisodiy ta'sirga ega: ko'plab asosiy ekinlar genetik jihatdan o'zgartirilgan hosildorlikni oshirish, zararkunandalarga va kasalliklarga chidamliligini berish, gerbitsidlarga qarshilik ko'rsatish yoki ularning ozuqaviy qiymatini oshirish. O'simliklar, boshqa barcha ma'lum tirik organizmlar singari, o'z xususiyatlarini ishlatib o'tadi DNK. O'simliklar boshqa tirik organizmlardan noyobligi bilan ajralib turadi Xloroplastlar. Yoqdi mitoxondriya, xloroplastlarning o'ziga xos xususiyatlari bor DNK. Hayvonlar singari o'simliklar ham tajribaga ega somatik mutatsiyalar muntazam ravishda, ammo bu mutatsiyalar mikroblar liniyasi somatik hujayralardan tashkil topgan novdalar uchida gullar rivojlanib borishi bilan osonlik bilan. Odamlar buni asrlar davomida bilishgan va mutant shoxlar "sport"Agar sportdagi mevalar iqtisodiy jihatdan maqbul bo'lsa, yangi nav olinishi mumkin. Ba'zi o'simlik turlari qodir o'z-o'zini urug'lantirish, ba'zilari esa deyarli faqat o'z-o'zini o'g'itlaydi. Bu shuni anglatadiki, o'simlik o'z avlodlari uchun ona va ota bo'lishi mumkin, bu hayvonlarda kam uchraydigan hodisa. Olimlar va turli xil o'simliklar orasida xoch yasashga qiziquvchilar, o'simliklarning o'z-o'zini urug'lantirishiga yo'l qo'ymaslik uchun maxsus choralarni ko'rishlari kerak. Yilda o'simliklarni ko'paytirish, odamlar yaratadilar duragaylar iqtisodiy va estetik sabablarga ko'ra o'simlik turlari o'rtasida. Masalan, hosil Makkajo'xori o'tgan asrda qisman gibrid makkajo'xori navlarini kashf etish va ko'paytirish hisobiga qariyb besh baravar oshdi.[14] O'simliklar genetikasi yordamida o'simliklarning qaysi kombinatsiyasi bilan o'simlik hosil qilishi mumkinligini taxmin qilish mumkin Gibrid quvvat, yoki aksincha, o'simlik genetikasidagi ko'plab kashfiyotlar hibridizatsiya ta'sirini o'rganishdan kelib chiqqan. O'simliklar, umuman olganda, tirik qolishga va haqiqatan ham gullashga qodir poliploidlar. Poliploid organizmlarda gomologik xromosomalarning ikkitadan ortiq to'plamlari mavjud. Masalan, odamlarda ikkita gomologik xromosomalar mavjud, ya'ni odatdagi odam 23 xil xromosomalarning har birida 2 nusxadan, jami 46 tadan iborat bo'ladi. Bug'doy boshqa tomondan, faqat 7 xil xromosomaga ega bo'lgan holda, geksaploid hisoblanadi va har bir xromosomaning 6 nusxasidan, jami 42 tadan iborat. Hayvonlarda nasldan naslga o'tadigan germlin poliploidiyasi kam uchraydi va xromosomalarning o'z-o'zidan ko'payishi hatto o'tgan urug'lanishda ham omon qolmasligi mumkin. O'simliklarda, ammo bu bunday muammo emas, poliploid shaxslar tez-tez turli xil jarayonlar natijasida hosil bo'ladi, ammo yaratilganidan keyin odatda ota-ona turiga o'tib bo'lmaydi. Poliploid shaxslar, agar o'z-o'zini urug'lantirishga qodir bo'lsa, yangi genetik jihatdan ajralib turadigan yangi naslni keltirib chiqarishi mumkin, bu yangi turning boshlanishi bo'lishi mumkin. Buni ko'pincha "tezkor" deb atashadi spetsifikatsiya". Poliploidlar odatda ko'proq mevalarga, iqtisodiy jihatdan maqbul xususiyatga va ko'plab oziq-ovqat ekinlariga, shu jumladan bug'doyga, makkajo'xori, kartoshka, yerfıstığı,qulupnay va tamaki, tasodifiy yoki ataylab yaratilgan poliploidlardir. Gen muhandisligining poydevori-rekombinant DNK lar texnologiyasi genetik struturalarini birga qo’shish texnikasi molekulyar biologiyaning eng muhim yutuqlaridandir. Bu texnologiyadan foydalanib zarur mahsulotni (oqsilni) kodlaydigan DNK molekulasining kichik bir qismi genni kesib olish, uning yot gen bilan kombinatsiyasini yaratish, so’ngra bu yangi genomni munosib hujayralarga kiritib xo’jayin hujayra DNKsining sintez mexanizmi yordamida ko’p martalab ko’paytirish mumkin. Sun’iy sharoitda rekombinant DNK olish va genlarni klonlash ilk bor 1972-yilda AQSh olimlari Boyer va Koen tomonidan amalga oshirilgan. Bu olimlar E.soli bakteriyasining xromosoma DNKsiga va shu bakteriya plazmidasiga alohida idishlarda EsoRI restriktaza fermenti bilan ishlov berganlar. Plazmida tarkibida faqat 1 dona EsoRI restriktaza fermenti tanib kesadigan maxsus nukleotidlar izchilligi bo’lganligi sababli ferment plazmidaning halqasimon DNK qo’sh zanjirini faqat bir joyidan kesib, plazmidani "yopishqoq" uchli ochiq holatga o’tkazadi. Xromosoma DNK molekulasida EsoRI restriktaza fermenti taniy oladigan maxsus nukleotidlar izchilligi qanday bo’lsa, bu molekula shuncha bo’lakka bo’linadi. Turli xil o’lchamga ega bo’lgan DNK molekulasi elektroforez uslubi yordamida ajratib olinadi. Ajratib olingan "yopishqoq" uchli xromosoma DNKsi bo’lagi ochiq holatdagi "yopishqoq" uchlik plazmida DNK si bilan aralashtirilib ligaza fermenti yordamida tiklanadi. Natijada plazmida tarkibiga xromosoma DNK bo’lagi kiritiladi.Shu boisdan rekombinant DNK ga quyidagicha ta’rif berish mumkin: har qanday tirik organizm irsiy molekulasining istalgan bo’lagini vektor molekulalariga birikishidan hosil bo’lgan sun’iy DNK rekombinant DNK deyiladi. Rekombinant DNK olishda uchta- konnektor, restriktaza ligaza va linker molekulalari usullaridan foydalaniladn. Konnektor usulida rekombinatsiyada ishtirok etuvchi DNK bo’dagining 3' uchiga dezoksinukleotidiltransferaza fermenti yordamida ma’lum uzunlikdagi oligo (dA) - segmenti ulanadi. Ikkinchi uchiga esa oligo ((dT) - segmenti ulanadi. Bu DNK bo’laklari aralashtirilganida dA va dT setmentlarning vodorod bog‘lari asosida komplementar birikishi tufayli halqasimon DNK strukturasi hosil bo’ladi. Hosil bo’lgan DNK dagi bir zanjirli bo’sh joylar DNK-polimeraza fermenti yordamida to’ldiriladi. Restriktaza-ligaza usuli eng sodda va oson rekombinant DNK olish usuli hisoblanadi. Bu usulda DNK molekulasi va vektor plazmida "yopishqoq" uchlar hosil kiluvchi restriktaza bilan qirqiladi va aralashtirilgan holda ma’lum sharoitda reassotsiatsiya qilinadi. Komplementarlik xususiyatiga ko’ra DNK molekulalari o’zaro vodorod bog‘lari yordamida birikib halqasimon struktura hosil qiladi va DNK zanjirining birikmagan joylari DNK-ligaza fermenti yordamida ulanadi. Linker molekulalaridan foydalanish usulida DNK molekulasiga va vektor plazmidaga T4 fag DNK-ligaza fermenti yordamida maxsus nukleotid ketma-ketligiga ega bo’lgan linker molekula ulanadi. Olingan ikki turdagi DNK molekulasi restriktaza fermenti yordamida qirqilib aralashtirilgan holda reassotsiatsiya qilinadi. DNK va vektor plazmida molekulalarining birikmagan joylari DNK-ligaza fermenti yordamida ulanadi. Shu yo’sinda rekombinant DNK molekulasi hosil bo’ladi.Rekombinant DNK avtonom replikatsiya bo’lishi uchun javob beradigan DNK bo’lagi vektor molekulalari deyiladi. Vektor molekulalar o’z vazifasiga ko’ra ikki tipga bo’linadi. Birinchisi avtopon replikatsiya bo’luvchi vektorlar. Ikkinchisi xromosomaga integratsiya bo’luvchi vektorlar. Vektor molekulalar gen muxandisligi biotexnologiyasida genlarni klonlashda va transformatsiya qilishda asosiy ish quroli bo’lib xizmat qiladi. Vektor molskulalari vazifasini fag DNK lari, plazmidalar va o’simliklarni xloroplast hamda mitoxondriya DNK lari o’tashi mumkin. Xo’jalik ahamiyati qimmatli bo’lgan genlarni ajratish uchun gen bibliotekasi tuziladi. Xromosomal DNK asosida gen bibliotekasini tuzish quyidagicha amalga oshiriladi: DNK va vektor molekulalar restriktaza fermenti yordamida qirqiladi va ma’lum sharoitda reassotsiatsiya qilinadi. Nukleotidlar orasida ulanmay qolgan bo’shliq DNK-ligaza fermenti yordamida o’zaro biriktiriladi. Olingan rekombinant DNK bakteriya hujayrasiga trangformatsiya qilinadi. Xromosomal DNKda mavjud genlarni to’la klonlash uchun DNK o’lchamiga va olingan klonlarni soniga e’tibor berish kerak. Bu ko’rsatgich quyidagi formula yordamida hisoblanadi, 1п (1-)1п (1-х/у) bunda: x-klonlanayotgan DNK o’lchami), u-gaploid genomning o’lchami va r=0,99 ga teng bo’lsa 99 ga teng xromosomal DNKning unikal qismi klonlanadi. Genlarni klonlashda ko’pincha kDNK bibliotekasini tuzish maqsadga muvofiqdir. Bu holda maxsus poli (Y) va oligo (dT) kolonkalari yordamida uchlarida poli (A) nukleotidlar ketma-ketligini saqlovchi iRNK tRNK va rRNK dan ajratib olinadi. Olingan iRNK molekulasi oligo (dT) nukleotidlari bilan aralashtirilib reassotsiatsiya qilinadi. Bunda iRNK molekulasining poli (A) uchida dA va dT qo’sh zanjirli segment hosil bo’ladi. Ushbu ikki zanjirli segmentning oligo (dT) uchi kDNK sintezini amalga oshiruvchi revertaza fermenti uchun praymer (kDNK sintezining boshlanish nuqtasi) vazifasini o’taydi. Sintez qilingan kDNK molekulasi qisqa uchli ikki zanjirli struktura bilan tugallanadi. kDNK sintezida matritsa vazifasini o’tagan iRNK molekulasi NaON bilan parchalanadi natajada qisqa ikki zanjirli va to’liq iRNK molekulasiga komplementar bo’lgan bir zanjirli kDNK molekulasi hosil bo’ladi. Hosil bo’lgan qisqa ikki zanjirli struktura kDNK ning ikkinchi zanjirini sintez qilishda praymer vazifasini o’taydi. DNK-polimeraza-I fermenti yordamida kDNKning ikkinchi zanjiri sintez qilinadi. Hosil bo’lgan kDNKning bir zanjirli qismi SI-nukleaza fermenti yordamida parchalanadi va ikki zanjirli kDNK molekulasi hosil bo’ladi. Shu yo’sinda hosil bo’lgan kDNK molekulasi vektor molekualariga ulangan holda klonlanadi. Har ikki usul bilan yaratilgan genom bibliotekasidan individual genlarni ajratib olish quyidagicha amalga oshiriladi rekombimant plazmida denaturatsiya qilinadi (100° S haroratda 5min., 0,2n NaOH eritmasida 15 min), bir zanjirli DNK molekulasi stabil qo’zg‘almaydigan holatda turishi uchun nitrotsellyuloza filtrga biriktiriladi. Olingan filtr [32R] ATF nukleotidi bilan nishonlangan iRNK molekulasi bilan gibridizatsiya :qilinadi. Molekulyar gibridizatsiya jarayonida filtrga birikkan rekombinant DNK molekulasiga komplementarlik qonuniyati asosida nishonlangan iRNK molekulalari birikadi.Hosil bo’lgan gibrid DNK molekulasi denaturatsiya qilinib nishonlangan iRNK molekulasi (elyutsiya yordamida) ajratib olinadi. Olingan iRNK molekulasi hujayrasiz oqsil sintez qilish tizimida tekshirib ko’riladi. Hosil bo’lgan oqsil molekulasining identifikatsiya qilish yo’li bilan individual genlarni ajratib olishga omalga oshiriladi. Download 0.77 Mb. Share with your friends:
|