Datum vypracování: 2004-10-21

Datum vypracování: 2004-10-21

„Bioinformatika.“

„Bioinformatics.“

„Blue gene.“

Na stránskách www.muni.cz najdete kontakt odborneho garanta seminare pana
doc. Mgr. Jiří Damborskeho, Dr.

doc. Mgr. Jiří Damborský, Dr.

Fakulta/Ústav Přírodovědecká fakulta
Katedra/Oddělení Národní centrum pro výzkum biomolekul
Kancelář pav. 07/02001 (Kotlářská 2, 611 37 Brno)
Telefon 549 49 3467
Fax 549 49 2556
E-mail jiri@chemi.muni.cz
WWW Home Page http://ncbr.chemi.muni.cz/~jiri/

Na stránkách http://www.cba.muni.cz/projekty/bioinformatics/program.htm

najdete program semináře Bionformatika II.

Program:

Bioinformatika s pomocí počítačů řeší biologické otázky. Někdy modeluje procesy nebo stavy, někdy zpřístupňuje data ve formě databází, někdy něco předpovídá (například předpovídá/nalézá geny a jiné "elementy" uvnitř nukleotidové sekvence tvořící chromozóm). Dále třeba předpovídá funkci bílkovin obsažených v předpovězených genech (rozuměj kódovaných těmi geny), předpovídá struktury molekul a jejich interakce (třeba s nějakými dalšími molekulami), porovnává jednotlivé organismy mezi sebou na základě různých kombinací genů v nich obsažených a v neposlední řadě na základě sekvenční odlišnosti určuje míru jejich příbuznosti. A to tento výčet jistě není úplný. Krátce řečeno, odcizila ostatním biologickým oborům vše co souvisí s počítači.

Když jsem někdy minulý týden ve svém PocketPC četl článek z New York Times (ale možná to bylo z něčeho úplně jiného), hovořilo se v něm o velmi zajímavé věci. Článek pojednával o nutné obměně generací lidí, kteří hýbou současným Internetem. Hovořilo se v něm o něčem, co už tvrdím asi dva roky. Současný Internet rozhýbala řada nadšenců, lidí nebojících se riskovat, přijímat rozhodnutí. Ti jej doposud řídí a v mnoha případech jsou to spíše nespoutaní ďáblové, než lidé hovící administrativě, pořádku, plánům, podnikatelským záměrům a vůbec všem těm zdánlivě zbytečným věcem.

Jenže, v článku se hovořilo o dvou důležitých záležitostech. Tou první byla skutečnost, kterou možná mnozí "hybatelé" Internetem pociťuji na vlastní kůži. Jde o jakousi vyčerpanost, "vyhořelost", nedostatek onoho prvotního elánu, nadšení, jásotu, zběsilosti a živelnosti. Po nějakých těch dvou až šesti letech, které tito lidé věnovali Internetu, se jim už jaksi "nechce". Po celou dobu pracovali určitě víc než 8 a půl hodiny denně. Neznali víkendy, pracovali dlouho do noci. A v některých případech zbohatli, v některých případech nikoliv. Každopádně dokázali nemožné. Posunout Internet kamsi daleko dopředu.

Druhá důležitá věc, uvedená v onom zmiňovaném článku, ovšem musí přijít. Musí nastoupit armáda administrativně orientovaných "řiditelů" a "ředitelů". Musí nastoupit klasické způsoby podnikání. Běžné obchodní vztahy, běžné problémy, běžné postupy. Smlouvy, dohody, spory. Ona původní skupina lidí, kteří dokáží hýbat věcmi tam, kde původně nic není, se ovšem na tento cíl jaksi nehodí. Prostě na to nemají žaludek. Jsou to vizionáři, lidé kteří vymyslí, postaví, prosadí a přivedou v život něco, na co by si "běžný" člověk netroufl. Zhroutil by se totiž již v okamžiku, kdy by zjistil, kolik práce a prostředků je potřeba, aplikoval by standardní poučky a postupy, a pak odsoudil většinu projektů v zapomnění na dně temné zásuvky.

O čem se ale také náhodou v článku hovořilo, bylo něco uplně jiného. Článek byl pochopitelně "emerický", takže jedna z osob, patřících do kategorie "Internetových buditelů", se jaksi mezi řečí zmínila, že teď si vezme tak šest měsíců dovolené, naučí se konečně surfovat a řídit letadlo. A pak se možná vrhna na biotechnologie, že to je právě ten obor co bude "frčet". A k Internetu? Tam se prý už asi nevrátí.

Pak jsem, ke konci minulého týdne, narazil na další článek. News.com informoval o investici 100 milionů dolarů do biotechnologické revoluce. IBM je tím, kdo chce vrazit 100 milionů dolarů do vývoje produktů na pomoc vědcům zkoumajícím masivní množství dat majících (možná) vztah k chování genů a proteinů. A součástí investice je založení nové divize, věnující se právě vědám zkoumajícím život. A IBM není samo, článek v News.com upozornil, že podobné investice již proběhly od společností jako HP či Sun!

Co víc, jde o pokračování investic do tohoto odvětví - IBM již loni v prosinci investovalo (také 100 milionů) do Blue Gene (ach, má oblíbená modrá barva!) iniciativy. Součástí investice je i vybudování superpočítače schopného pomoci porozumět vytváření proteinů! A aby se vše zhodnotilo, IBM samozřejmě vytvořilo novou obchodní jednotku, ta prodává počítače a služby určené biotechnologii, zdravotnictví, farmaceutice, genetice a dalším podobným vědeckým odvětvím. Ona se totiž biotechnologie (a genetika) bez pořádného počítačového výkonu prostě neobejde (viz. třeba článek Dolování dat pomáhá vědcům)

Něco na tom tedy asi bude, že zrovna biotechnologie (přezdívaná ve zkratce biotech) může být právě tím oborem, kam prchnou ti správní vizionáři a buditelé. Což mi nedá nevzpomenout na stále se množící informace o (dalo by se i říci) aférách týkajících se právě biotechnologie. Patří sem notoricky známá klonovaná ovce Dolly, nedávné oznámení o uzavření projektu mapování lidského genomu, snahy o patentování genetických informací (horké téma v USA) a různé úvahy o využití genetického inženýrství (něco málo třeba v článku Balancování nad genetickou propastí).

Co vy na to?

Bioinformatika motivuje dodavatele hardwaru i softwaru k vývoji stále výkonnějších počítačů i chytřejších algoritmů. Jaká je ale podstata oněch výpočetně náročných úloh, od kterých se současně tolik očekává např. ve farmaceutickém průmyslu? V následujícím článku si představíme několik z nich.

Začít můžeme např. vyhodnocováním klinických a dalších testů, které jsou součástí cyklu vývoje léků. V podstatě se jedná o obyčejnou statistiku. Zajímavou však úlohu činí skutečnost, že neexistují pouze látky účinné a neúčinné, ale také léky působící pouze za určitých podmínek nebo u určitých skupin obyvatelstva. Informatika pak musí dodat nástroje, které dokáží v ohromných souborech dat vyhmátnout na první pohled unikající souvislosti.

Léky šité na míru

Příkladem je třeba kauza léku BiDil, který je určen na srdeční choroby (podrobněji referoval např. server Osel.cz, viz http://www.osel.cz/index.php?obsah=6&clanek=843).

„Tato koncepce se označuje jako farmakogenomika a věští se jí světlá budoucnost. Vývoj nového léku je bohužel náročný a drahý a farmaceutické firmy nejsou dobročinné organizace. Musejí vydělávat a to znamená, že se jim nemalé investice musejí vrátit. To značně omezuje vývoj léků, které by působily jen na malé skupiny lidí – Afroameričané jsou v tomto směru populace dosti početná a relativně movitá. Potenciální trh s lékem pro opravdovou menšinu by byl příliš malý. Prozatím se dá proto počítat spíše s tím, že lékaři budou na základě výsledků výzkumu ve farmakogenomice volit ze stávajících preparátů ty, u kterých bude pro danou skupinu obyvatel menší riziko nežádoucích vedlejších účinků,“ uvádí k tomu Prof. Ing. Jaroslav Petr, DrSc., který pracuje ve Výzkumném ústavu živočišné výroby v pražské Uhříněvsi a přednáší biotechnologie na České zemědělské univerzitě.

Michael Storek,

Již téměř klasickou úlohu z oblasti bioinformatiky představuje sekvenování, tedy "čtení" DNA písmenko po písmenku. Nejznámějším případem je samozřejmě projekt lidského genomu.

Popsaná úloha vypadá triviálně, je však třeba si uvědomit, že před sebou máme řetězce dlouhé miliardy písmenek. Samozřejmě, že úlohu můžeme "řešit" prostě tak, že veškeré existující rozstříhané sekvence složíme lineárně za sebe. Takový výsledek bude vyhovovat zadání v tom smyslu, že uplatníme všechny sekvence - my jsme ale DNA stříhali a potřebujeme samozřejmě najít překryvy. V úloze jde vlastně o to, že hledáme nejkratší řetězec vyhovující všem podmínkám, minimum v obrovském stavovém prostoru. Po stránce algoritmu má úloha blízko ke známému problému obchodního cestujícího.

Klíčovou proceduru, která by mohla výrazně zefektivnit vývoj léků, představuje počítačové modelování 3D struktury proteinů. Právě 3D struktura má přitom těsný vztah i k biologické funkci.

Kladistické analýzy bývají využívány především v evoluční biologii. Zhruba řečeno v nich vycházíme z toho, že jednotlivé druhy se od sebe postupně oddělovaly známým "stromečkem". Jak ale určit konkrétní průběh onoho větvení?

Následující aplikace je od vlastní bioinformatiky poněkud odlehlá, nicméně dobře ukazuje, že některé jednou vzniklé algoritmy mají mnohem obecnější uplatnění.

Speciální kapitolou bioinformatiky jsou pak také tzv. DNA počítače a DNA čipy, kterým jsme se věnovali na Science Worldu již opakovaně, naposled v článku DNA počítače odhalí nádorové buňky.

Signalling Pathways and Reactive Oxygen and Nitrogen Species in the Vasculature

One key areas of research concerns the gas nitric oxide, which is biosynthesised from L-arginine in both endothelial cells, platelets and macrophages. Nitric oxide relaxes smooth muscle cells and inhibits platelets activation. We have been interested particularly in the interactions of nitric oxide with reactive oxygen species such as hydrogen peroxide and superoxide anions. The latter react with NO to form peroxynitrite which in turn modifies proteins by nitration of tyrosine residues. We have shown already, in platelets, that nitration of platelets is a naturally occuring phenomenon. Nitration is clear important in pathological tissues e.g. there is a large accumulation of nitrated proteins in atherosclerotic lesions. We have also found that there may be mechanisms by which the nitro group may be removed. This may be of relevance to tyrosine phosphorylation mechanisms in cell activation and inhibition, since we have preliminary evidence that nitration may block some of the phosphorylation sites, at least transitorally.

The aim of the projects in this area would be to investigate the role of nitration in tyrosine signalling mechanisms in platelets and the endothelium.

Other projects concern the role of tissue factor, best know as the initiators of the soluble coagulation cascade. Tissue factor, a transmembrane glycoprotein, has other roles in relation to cell proliferation and development of blood vessels via signal transduction mechanisms. We are currently interested in the mechanism by which tissue factor, particularly its cytoplasmic domain, can interact with known signalling mechanisms.

Molecular structures of proteins in infection, inflammation and immunity

(1) Structural determinations of the antibody classes and their interactions with receptors: the different forms of IgA. There are five antibody classes. Monomers and dimers of immunoglobulin IgA are extremely abundant in body secretions, yet their structures are poorly known. In addition IgA forms a number of important complexes with secretory component and with IgA alpha-receptors. We are using a range of technologies to determine protein structures at medium resolution using a novel methodology based on synchrotron X-rays at Daresbury (Cheshire), neutrons at the Rutherford (near to Oxford) and the ILL (Grenoble, France), and an analytical ultracentrifuge in our laboratory. We then use protein structure modelling methods performed on a cluster of modern Silicon Graphics Workstations using molecular graphics to determine the structures. The antibody structures will be correlated with the unique immunological role of IgA, possibly by additional experimentation in collaboration with our collaborators at Ninewells Hospital in Dundee. Related projects on offer may include work with the IgG and IgD classes, and with the antibody receptors themselves using the same technology. See Boehm et al (1999) and Perkins et al (1998).

(2) Expression and NMR or crystallographic structure determinations of complement proteins important in inflammation: factor B and properdin. The components of the complement system provide a major non-adaptive immune defence mechanism for its host. These are activated in response to the challenge of foreign material in plasma. Complement activation proceeds through a series of limited proteolytic steps in one of three pathways, the alternative, the classical and the lectin pathways.

The serine protease factor B plays a key role in the alternative pathway of activation and control of complement. Once the central protein C3 is activated, it forms a complex with factor B (C3b.FB) which is activated to form C3b.Bb, a protease which activates more C3, and enhances C3 deposition to promote opsonisation. We have made progress towards understanding the unique functional role of the five domains in FB data by a combination of molecular biology expression studies, NMR and crystallographic approaches, and projects are available in these areas.

Human properdin is an essential regulator of the activation of the alternative pathway, as it stabilises the complex between C3b and factor B. It contains a novel small thrombospondin type I repeat domain, the second most abundant domain type in complement, which occurs in many other multidomain proteins. Its molecular structure is wholly unknown. We have successfully over-expressed five TSR domains of properdin and obtained high-quality NMR spectra. There are chances to determine the molecular structure of several of these domains in order to describe the full structure of properdin using an appropriate combination of multinuclear NMR and protein crystallography in the first instance, followed by X-ray and neutron scattering and analytical ultracentrifugation. See Hinshelwood et al (1999).

(3) Molecular modelling of mutation sites in proteins. Bioinformatics strategies and protein homology modelling are invaluable tools to help interpret a rapidly increasing database of known natural human genetic mutations that result in dysfunctional proteins. We work with several Departments to examine these, most notably the Haemophilia Unit at the Royal Free Hospital, one of the three largest in the UK, where many patients reveal novel mutations in their blood coagulation proteins. Other relevant proteins include membrane proteins and developmental proteins. The significance of these mutations is not clear without performing molecular biology expression work to test the behaviour of the mutant proteins, in combination with structural studies to decipher the effect of the mutation on protein folding or activity. Projects on offer will include the development of an integrated database using bioinformatics technology for interrogation in order to interpret these mutations and those yet to be identified, as well as appropriate wet lab work. See Jenkins et al. (1998).

My group together with Professor Robert Hider and his colleague at KGT, Kings College and Professor John Porter at Royal Free and University College Medical School have been awarded a MRC co-operative group status. This award also includes two component grants. In addition to this I have project grants from The Wellcome Trust, EU, BBSRC, Sir Jules Thorn Charitable Trust and NKRF.(See Current Grants)

Objectives: To characterise genes that are responsible for cellular iron trafficking and for intestinal iron absorption and regulation. To quantify genetic and environmental contribution to the control of body iron stores To quantify the influence of various plasma factors (which are altered as a result of iron deficiency, hypoxia, pregnancy and increased erythropoesis) on the control of intestinal iron absorption.

Background:
Iron is the only nutrient of which there is a known widespread deficiency in the UK, with up to 25% prevalence in certain sociodemographic groups ( including women of child bearing age, vegetarians and adolescent females). Conversely, primary iron overload (genetic haemochromatosis) is the most common genetic disorder in the UK. Treatment of iron deficiency in the population may increase the penetrance (currently low) of genetic haemochromatosis with toxic consequences. On the other hand, it is not known how genetic factors interact with the known variability of food-iron bio-availability to determine body iron stores. Gene cloning projects have recently identifies an array of genes that contribute to the mechanism and regulation of iron absorption.

The following projects will be running in parallel with the ultimate goal of achieving the above aims.

Project 1.
Molecular mechanism of iron transfer across the placenta: Immunohistochemical localisation and role of DCT1 (DMT1), Ireg1, and hephaestin in iron transfer across placenta.

( The Wellcome Trust Project grant :Sep 2000- Dec 2003; £ 220,000).

Iron transfer in placenta can be considered in three stages, uptake across the placental microvillous border membrane, transfer across the placental cell and efflux into the fetal circulation. Iron uptake across the microvillous brush border is through transferrin receptor and receptor mediated endocytosis. Very little is known about transfer across the cell or the efflux of iron from the placenta into the fetal circulation. Recently however, there have been several different discoveries (cloning of divalent cation transporter DCTI (DMTI), cloning of Iregl and caeruloplasmin homologue, Hephaestin), which may provide information necessary to elucidate the mechanism of iron efflux across the placental basolateral membrane.

Hypothesis: DCTI (DMTI) and or lregl is localised to the basolateral membrane and involved in the efflux of iron into fetal circulation. This is co-localised with hephaestin" which oxidises ferrous to ferric iron prior to its binding to transferrin in the fetal circulation.

Sub-cellular localisation of DCT1 (DMTI), Iregl and Hephaestin will be investigated using antibodies raised against synthetic peptides. Once localisation of these proteins has been determined, regulation of these proteins by dietary iron and their involvement in the regulation of iron transfer across placenta, particularly efflux across the basolateral membrane, will be determined.

Rats will be used to study the effect of decreasing dietary iron on the regulation of DCTI (DMTI), Iregl and Hephaestim. BeWo cells in culture will be employed to study the effect of iron deficiency on transfer of iron across the placenta and its regulation in relation to expression and localisation

The information obtained from these studies will be used to devise iron supplementation regime for pregnant mothers in order to prevent iron deficiency in both the mother and the child.

Project 2:
The molecular regulation of iron absorption with reference to the defect in haemochromatosis Dr SKS SRAI (Sir Jules Thorn Charitable Trust Project Grant: Nov 1999 - Oct 2001: £82,000) (MRC Grant under consideration) Dr SKS Srai, Dr A Bomford, Dr R Simpson & Dr E Debnam) The mutation for hereditary haemochromatosis (HH) is the commonest genetic abnormality in people of Northern European descent. The recent cloning of HFE, the gene for HH, has not yet led to an increased understanding of the molecular defect, which is expressed as increased iron absorption from a normal diet, because

1. regulation of absorption of dietary iron under normal conditions is not understood and the role of wild type HFE in the process is unclear.

2. evidence for mechanistic linkage between HFE and the genetic component of the mucosal iron transport pathway are lacking.

Plan: Information on the function and the regulation of the mucosal iron transport pathway is urgently needed. We propose a detailed genetic and functional analysis of the component of this pathway in HH using information on novel genes derived from an initial study by our group, of inbred mouse strains with well characterised defects in mucosal iron transport. This initial study has led to the cloning of ferric reductase in the apical membrane of the villus enterocytes and in the basolateral membrane, transporter which is responsible for iron efflux. Gene expression studies at the mRNA and protein levels using duodenal tissue samples will be performed together with in situ techniques to obtain information on localisation of transcript along the crypt-villus axis. These results should permit further analysis of how individual genes in the iron transport pathway are regulated.

Project 3:
Molecular mechanisms involved in the dietary regulation of DMT1 expression in human intestinal epithelial cells Dr SKS Srai (RF&UCMS) & Dr P Sharp (Surrey University){ BBSRC Joint Project Grant Oct2000 - Sep2003: £189,444)
The nutritional significance of maintaining adequate dietary levels of the transition metals iron, zinc and copper is clear due to their essential role in a plethora of biochemical events in the body. This is confirmed by the large number of pathologies associated with imbalances in metal ion homeostasis. There is good evidence, from studies on animals and cell lines, that dietary levels of individual metals can influence the absorption and utilisation of others. Our study, using the Caco-2 TC7 cell model of human enterocytes, will investigate the biochemical basis for these dietary interactions and will focus on the putative metal ion transporter, DMT1. The data from this project will advance our knowledge of diet-gene interaction in regulating mineral metabolism at the cell and molecular level, and is thus relevant in understanding the underlying causes of metal ion deficiency and overload disorders.

The objectives of this work are to test the hypothesis that DMT1 acts as a divalent metal ion transporter in human enterocytes and that its activity can be regulated by dietary levels of nutritionally important trace metals. This hypothesis will be tested using the Caco-2 TC7 cell model of human small intestinal enterocytes and the work will address the following issues:

1. Functional measurement of metal ion transport in Caco-2 TC7 cells in response to chronic adaptations (10 days) in dietary levels of iron, zinc or copper.
2. Effect of these dietary changes on the expression of the putative metal ion transporter, DMT1, at the protein (western blotting) and mRNA (RT-PCR) level.
3. Cellular distribution of the two splice variant of the DMT1 gene, following dietary metal ion manipulation, using confocal microscopy.
4. The molecular events underlying changes in DMT1 homeostasis, focussing on the 5' promoter region of the gene and in particular the role of the 5 metal response elements, using luciferase reporter gene assays.
The role that DMT1 plays in the transport of iron, zinc and copper using site directed mutagenesis and the Xenopus oocyte expression system.

Project 4: Evaluation of the safety and efficacy of iron supplementation in pregnant women.

European Commission Framework V Grant (Feb 2000 - Jan 2003) £1,101,077 with eight other partners. Dr Srai (RF&UCMS) & Dr McArdle's (The Rowett Research Institute) share £194,917 for 1 RA1B and 1 PhD student.

Iron deficiency is common and can have harmful effects on the mother and her foetus. Anaemia is therefore always treated with iron supplements. However levels given vary widely and there is a Growing concern about the risks associated with iron overload. Since iron can generate free radicals, and interact with other nutrients, assessment of supplementation in pregnant women is essential. Volunteers will be given two levels of iron with in the range given clinically, or a placebo, and the effects of parameters such as oxidative stress, cardiovascular well being, zinc and copper metabolism will be measured. We will study treatment directly in patients with ileostoma, identifying the cause of GI upset. We will measure the effects on babies at term, on placental function and on expression of different genes in supplemented rats and cultured cells, to elucidate the molecular basis of the change and a rational basis for supplementation.

Project 5: Haem metabolism and control of intestinal iron absorption. Dr SKS Srai (RF&UCMS) & R Simpson (King's College, KGT) {MRC project grant Oct 2000 - Sep2003; £171,241)

Background: Iron homeostasis is maintained primarily by controlling intestinal iron absorption of dietary iron. Alterations in body iron levels (deficiency/overload) are often associated with important and clinical consequences. The mechanism and regulation of the absorptive process is however, unclear. Modifications in haem biosynthesis in animals and human (experimental/accidental/ genetic) have been reported to induce changes in iron metabolism and iron absorption. The relationship between the two parameters is however, not well understood. We will investigate, at the cellular and molecular level, how dynamic changes in levels of haem and intermediates of its biosynthesis (particularly ALA) affect intestinal iron transport. These studies will help to further clarify the iron absorption regulatory process and elucidate changes in iron metabolism in certain porphria and haemoglobinopathies.

We will assay urinary ALA and phorphobilinogen output, urinary and biliary porphyrins, tissue haem levels and enzymatic activities in mice with altered iron metabolism (hypoxic, dietary iron deficient, hypotransferrinaemic, iron loaded). In addition, the effects of ALA administration on gene expression and iron absorption will be ascertained in these mouse models. We will study the mechanism by which ALA and other specific regents influence haem biosynthesis and iron transport in epithelial cells
MOLECULAR MECHANISM OF POLYPHENOL ABSORPTION, METABOLISM AND ANTIOXIDANT EFFECT
Dr SKS SRAI, Dr E DEBNAM (RF& UCMS) AND Prof C RICE-EVANS (Guy's Hospital, KGT) (BBSRC Project Grant Jan 2001 - Mar 2003; £118,000)
Professor Rice -Evans is the principal applicant
Gastrointestinal factors, influencing the metabolism and functional activities of dietary, plant polyphenols.

The importance of dietary antioxidants in the maintenance of health and protection from damage induced by oxidative stress, implicated in the risk of chronic diseases, is coming to the forefront of dietary recommendation and the development of functional foods. Recent work is beginning to highlight a role for flavonoid and polyphenolic component of the diet, known to be powerful hydrogen donating antioxidants and scavengers of reactive oxygen and reactive nitrogen species in vitro.